?各區(qū)市場(chǎng)監(jiān)管局，房山區(qū)燕山市場(chǎng)監(jiān)管分局，市市場(chǎng)監(jiān)管局機(jī)場(chǎng)分局，經(jīng)開區(qū)商務(wù)金融局，市藥監(jiān)局各分局，各相關(guān)事業(yè)單位：
??為深入貫徹落實(shí)醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管相關(guān)法規(guī)要求，進(jìn)一步規(guī)范北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查工作，持續(xù)強(qiáng)化醫(yī)療器械生產(chǎn)科學(xué)監(jiān)管，市藥監(jiān)局組織對(duì)《聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查要點(diǎn)指南（2016版）》進(jìn)行了修訂，形成《北京市聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查指南（2024版）》，現(xiàn)印發(fā)給你們，請(qǐng)參照?qǐng)?zhí)行。
??特此通知。
北京市藥品監(jiān)督管理局
2024年12月6日
北京市聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)室檢查指南（2024版）
??聚合酶鏈反應(yīng)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室是指通過基因擴(kuò)增的方式檢測(cè)特定的DNA或RNA的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種在體外特異性擴(kuò)增靶DNA序列的技術(shù)，其基本過程為模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火和在DNA聚合酶引導(dǎo)下的鏈延伸反應(yīng)三個(gè)階段的多次循環(huán)。每一次循環(huán)后的擴(kuò)增產(chǎn)物均可作為下一輪循環(huán)的模板，理論上，擴(kuò)增產(chǎn)物量呈指數(shù)形式上升，即經(jīng)過n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)物量增加到2n倍，短時(shí)間內(nèi)在體外可獲得數(shù)百萬個(gè)特異靶DNA序列的復(fù)制，為預(yù)測(cè)、預(yù)防、診斷、治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后觀察和健康狀態(tài)評(píng)價(jià)提供了一種極有幫助的實(shí)驗(yàn)室輔助手段。
??PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室是PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品檢驗(yàn)過程中不可缺少的工作環(huán)境，其環(huán)境控制水平和質(zhì)量管理水平直接影響著最終產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于該產(chǎn)品本身的特殊性，《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑》、《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場(chǎng)檢查指導(dǎo)原則》條款中，對(duì)PCR試劑的生產(chǎn)和檢驗(yàn)環(huán)境做出明確規(guī)定。此外現(xiàn)行衛(wèi)生行業(yè)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)文獻(xiàn)中對(duì)于PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室均作出規(guī)定，主要涉及《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)）以及《實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)臨床實(shí)驗(yàn)室 應(yīng)用指南》（WS/T 230-2024）等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。
??本檢查指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械監(jiān)管人員增強(qiáng)對(duì)PCR檢驗(yàn)相關(guān)過程的認(rèn)知和把握，指導(dǎo)全市醫(yī)療器械監(jiān)管人員對(duì)PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)與質(zhì)量控制的監(jiān)督檢查工作。同時(shí)，為PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)建造和管理要求提供參考。
??本指南中涉及或引用的國(guó)家相關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章、標(biāo)準(zhǔn)、檢查指南等發(fā)生內(nèi)容或效力變化時(shí)，要以當(dāng)時(shí)執(zhí)行的最新版為準(zhǔn)。必要時(shí)，北京市藥品監(jiān)督管理局應(yīng)重新研究修訂，以確保本指南持續(xù)符合要求。
??一、適用范圍
??本檢查指南可作為北京市藥品監(jiān)督管理局組織、實(shí)施的體外診斷試劑產(chǎn)品注冊(cè)質(zhì)量管理體系現(xiàn)場(chǎng)核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)許可現(xiàn)場(chǎng)核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查等涉及PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查的參考資料。
??基因測(cè)序檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室等涉及PCR試劑的相關(guān)部分應(yīng)當(dāng)參照本檢查指南執(zhí)行。
??二、檢查要點(diǎn)
??（一）PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室布局
??生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)提供PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)方案和/或平面設(shè)計(jì)圖（應(yīng)當(dāng)標(biāo)明風(fēng)向或壓差梯度）。
??1.PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室與PCR試劑生產(chǎn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)在各自獨(dú)立的建筑物或空間內(nèi)，保證空氣不直接連通，防止擴(kuò)增時(shí)形成的氣溶膠造成交叉污染。
??2.原則上PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。若使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀且不需要進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)物分析工作，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。若使用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)為一體的自動(dòng)化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。合并的區(qū)域需采取相應(yīng)生物安全防護(hù)和避免環(huán)境污染的措施。
??3.各區(qū)域在物理空間上應(yīng)當(dāng)完全相互獨(dú)立，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)。不應(yīng)當(dāng)只是形式上的分區(qū)，不應(yīng)當(dāng)是一個(gè)區(qū)域嵌套一個(gè)區(qū)域。
??4.各區(qū)域不應(yīng)當(dāng)有空氣的直接連通。擴(kuò)增區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)各區(qū)域宜采用獨(dú)立直排方式出風(fēng)。采用空調(diào)機(jī)組方式的，PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)具備獨(dú)立空調(diào)機(jī)組；同時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮停機(jī)后各房間空氣連通的可能性，采取必要的控制措施。
??5.按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力應(yīng)當(dāng)以遞減的方式進(jìn)行，使得PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向應(yīng)當(dāng)按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域?？諝饬飨驊?yīng)當(dāng)為單向，禁止下游污染上游。應(yīng)當(dāng)設(shè)置合理的壓差梯度，并安裝壓差監(jiān)測(cè)裝置，以有效證明空氣流向，壓差梯度不宜低于5帕。PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)可參考附件進(jìn)行設(shè)計(jì)。
??6.設(shè)置緩沖間的，緩沖間內(nèi)通向?qū)嶒?yàn)室和走廊的門應(yīng)當(dāng)安裝互鎖裝置或采取相應(yīng)措施，避免出現(xiàn)兩個(gè)門同時(shí)打開的情況。
??7.各區(qū)間若設(shè)置傳遞窗，應(yīng)當(dāng)為雙側(cè)開門，要求密封嚴(yán)實(shí)，并且兩側(cè)的門應(yīng)當(dāng)為互鎖裝置或采取相應(yīng)措施確保兩側(cè)門不會(huì)同時(shí)開啟。
??（二）儀器設(shè)施配置
??1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)的功能：儲(chǔ)存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的儲(chǔ)存和準(zhǔn)備。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：
??（1）符合儲(chǔ)存溫度要求的冰箱；
??（2）混勻器；
??（3）離心機(jī)；
??（4）水浴箱或加熱模塊；
??（5）微量加樣器；
??（6）紫外消毒設(shè)備；
??（7）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、耐高壓處理和（或）一次性的離心管和加樣器吸頭；
??（8）專用工作服和工作鞋（套）。
??2.標(biāo)本制備區(qū)的功能：核酸（RNA、DNA）提取、儲(chǔ)存及加樣。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：
??（1）符合儲(chǔ)存溫度要求的冰箱；
??（2）離心機(jī)；
??（3）混勻器；
??（4）水浴箱或加熱模塊；
??（5）微量加樣器；
??（6）紫外消毒設(shè)備；
??（7）生物安全柜；
??（8）核酸提取設(shè)備；
??（9）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、耐高壓處理和（或）一次性的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）；
??（10）專用工作服和工作鞋（套）；
??（11）如需處理大分子DNA，應(yīng)當(dāng)具有超聲波設(shè)備。
??3.擴(kuò)增區(qū)的功能：cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測(cè)。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：
??（1）核酸擴(kuò)增設(shè)備；
??（2）微量加樣器；
??（3）離心機(jī)；
??（4）紫外消毒設(shè)備；
??（5）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、耐高壓處理和（或）一次性的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）；
??（6）專用工作服和工作鞋（套）。
??4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的功能：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測(cè)定。視檢驗(yàn)方法不同而定，基本配置如下：
??（1）分析設(shè)備；
??（2）微量加樣器；
??（3）紫外消毒設(shè)備；
??（4）符合儲(chǔ)存溫度要求的冰箱；
??（5）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、加樣器吸頭（帶濾芯）；
??（6）專用工作服和工作鞋（套）。
??上述各區(qū)域儀器設(shè)備為一般配置，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù)使用的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)或試劑的特點(diǎn)，對(duì)儀器設(shè)備進(jìn)行必要的增減。
??5.設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)
??應(yīng)當(dāng)建立設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)規(guī)程，計(jì)量設(shè)備應(yīng)當(dāng)定期檢定或校準(zhǔn)。例如核酸擴(kuò)增設(shè)備、微量加樣器等應(yīng)當(dāng)每年進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)工作。
??（三）工作流程及注意事項(xiàng)
??1.單次實(shí)驗(yàn)進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。
??2.各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。
??3.不同工作區(qū)域的工作服應(yīng)當(dāng)加以區(qū)分，不得混用（例如可以采用不同顏色）。
??4.實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具并防止交叉污染。實(shí)驗(yàn)垃圾屬于醫(yī)療廢物的應(yīng)當(dāng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理。
??5.工作結(jié)束后，應(yīng)當(dāng)立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔及消毒。
??6.儲(chǔ)存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。應(yīng)當(dāng)對(duì)加樣吸頭、PCR反應(yīng)管等消耗品進(jìn)行防護(hù)，防止被污染。使用的試劑和耗材不應(yīng)當(dāng)對(duì)產(chǎn)品檢驗(yàn)造成干擾。
??7.加入待測(cè)核酸時(shí)，應(yīng)采取相應(yīng)的措施避免樣本間的交叉污染。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，應(yīng)當(dāng)在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。
??8.如需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行開蓋處理的，應(yīng)當(dāng)采取相應(yīng)的措施避免氣溶膠所致的污染。
??9.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)如存在溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等有毒有害物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)，必要時(shí)配備通風(fēng)櫥等防護(hù)設(shè)備。
??（四）人員培訓(xùn)情況
??參與PCR檢驗(yàn)的工作人員應(yīng)當(dāng)具備相應(yīng)的專業(yè)知識(shí)和技能，包括能熟練操作相關(guān)設(shè)備，明確整個(gè)工作的流程，掌握出現(xiàn)污染情況的處理方法以及實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制方法和檢測(cè)結(jié)果的解釋。
??檢查人員可以通過詢問或要求人員實(shí)際操作對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，也可以通過查閱人員培訓(xùn)記錄，對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。
??（五）文件管理情況
??結(jié)合實(shí)際建立對(duì)PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理體系文件，制定相關(guān)程序文件、操作規(guī)程等，并保留相應(yīng)記錄。相關(guān)質(zhì)量管理體系文件包括但不限于實(shí)驗(yàn)室管理制度、人員管理制度、樣本管理制度、實(shí)驗(yàn)室防護(hù)管理制度、廢棄物管理制度等，以及相關(guān)設(shè)施設(shè)備運(yùn)行與維護(hù)操作規(guī)程、檢驗(yàn)規(guī)程等。
??在檢查過程中應(yīng)當(dāng)特別注意現(xiàn)場(chǎng)查看、詢問、記錄的實(shí)際情況與生產(chǎn)企業(yè)的文件規(guī)定、記錄的符合性。
??附件：1.理想的PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)
??2.參考資料
?
圖B ?緩沖間為正壓的理想PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置模式
??圖A和圖B所給出的PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置圖是較為理想的設(shè)置模式，建議企業(yè)參照此種模式設(shè)計(jì)并建立實(shí)驗(yàn)室。
?????? 附件2
??參考資料
??1.《關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第64號(hào)）
??2.《關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2015年第103號(hào)）
??3.《關(guān)于印發(fā)醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范現(xiàn)場(chǎng)檢查指導(dǎo)原則等4個(gè)指導(dǎo)原則的通知》（食藥監(jiān)械監(jiān)〔2015〕218號(hào)）
??4.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第4版）
??5.《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)）
??6.《實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng) 臨 床 實(shí)? 驗(yàn) 室應(yīng)用指南》（WS/T 230-2024）
??7.《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》（GB 50346-2011）
??8.《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB 19489-2008）